分子生物学

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分子生物学实验



一、基本目的:

使学生掌握基础分子生物学实验的基本原理,训练学生分子生物学实验的技能和操作。

二、核心概念:

1、质粒DNA的分离纯化

2、质粒DNA的限制性内切酶酶切

3、琼脂糖凝胶电泳

4、大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA分子导入原核细胞

5、应用PCR基因扩增技术进行性别检测

三、教学内容

实验模块序号

实验题目

实验目的


核心概念

实验内容

实验技术

实验仪器

学时

1

质粒DNA的分离纯化

了解质粒载体的基本结构特性,掌握提取纯化质粒DNA的技术,学会离心设备的使用,学会细菌的培养。

质粒

质粒载体

质粒图谱

1.培养过夜菌。

2.离心收集菌体。

3.悬浮菌体沉淀。

4.裂解菌体。

5.中和去除沉淀。

6.上清液加入吸附柱。

7.洗去杂质后洗脱得到质粒DNA。

掌握移液器和离心机的使用方法,

移液器

离心机

6

2

质粒DNA的限制性内切酶酶切

了解限制性内切酶及酶切的条件,学会分析质粒DNA的酶切图谱。

细菌的限制和修饰系统

限制性内切酶的分类及特性

质粒酶切图谱

多克隆位点


1.用微量移液器按照设定的酶切体系将各种试剂分别加入每个离心管内。

2.加样后,混匀并用瞬时离心机离心。

3.置于37℃恒温培养箱内,酶切2-3小时。

4.取出存放-20℃冰箱。

正确使用移液器转移微量液体,建立酶切体系。

移液器

瞬时离心机

恒温培养箱


6

3

琼脂糖凝胶电泳

系统掌握琼脂糖凝胶电泳的基本技术,学会分析电泳图谱。

琼脂糖凝胶

DNA电泳

DNA染色

分子量标准


1.琼脂糖凝胶制备。

2.DNA样品处理。

3. 加样。

4. 电泳。

5.用凝胶自动成像系统拍照。

6. 分析电泳图谱。

配制TAE缓冲液,制备琼脂糖凝胶,电泳。


电子分析天平

制胶装置

电泳槽

电泳仪

凝胶成像仪

6

4

大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA分子导入原核细胞


了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义,学习氯化钙法制备E.coli  DH5α感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

转化

感受态

细胞转化

筛选转化体

插入失活

蓝白斑显色

氨苄抗性(Ampr)



1.配制LB固体培养基,高压灭菌后制成平板。

2. CaCl2法制备感受态细胞.

3.细胞转化.

4.观察结果.



无菌操作技术

高压灭菌

移液器

电子分析天平

台式离心机

恒温水浴

灭菌锅

无菌操作台

摇床

恒温培养箱


8

5

应用PCR基因扩增技术进行性别检测


使学生了解用PCR进行基因扩增的原理,影响因素及注意事项。

DNA的半保留复制

Taq DNA聚合酶

DNA变性及复性

1.提取口腔上皮细胞基因组DNA

2. Y染色体特异片段及Alu 基因的扩增

(1)在微量离心管内加入缓冲液,模板DNA,4种dNTP,两种DNA引物和Taq酶,混匀。

(2)将样品管置于PCR扩增仪中并设定温度条件,进行扩增。

(3)PCR反应结束,用琼脂糖凝胶电泳鉴定。


PCR反应引物的设计

设定PCR体系

移液器

瞬时离心机

PCR扩增仪

制胶装置

电泳槽

电泳仪

凝胶成像仪

8

四、教学方式

实验教学,1人或2人一组,课堂教学。

五、推荐教材或参考书/参考资料

1.郝福英,周先碗,朱玉贤,基础分子生物学实验,高等教育出版社,2010。

六、学生成绩评定方法

将课堂成绩和实验报告成绩汇总即为学期成绩。课堂成绩包括预习、实验操作、实验结果等。

七、授课教师:文津(wenjin@pku.edu.cn)候巧明(qiaoming@pku.edu.cn


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